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探讨泡沫病毒转录激活因子调控宿主细胞周期并受宿主细胞microRNA

更新日期:2012-05-05 | 点击: 次 | 一键收藏本文

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专业名称: 微生物学

论文级别: 博士

学位年度: 2009

中文摘要: 病毒是一种病原体,由于自身包装能力的限制,所以必须依赖于宿主细胞进行增殖与复制,并且对宿主细胞造成破坏。与此相反,宿主细胞在病毒进入到自身后,马上会启动其防御机制,抵抗、削弱、甚至清除病毒感染。本论文主要以泡沫病毒为研究工具,研究该类病毒对宿主细胞,特别是宿主细胞周期的抑制作用。以及宿主microRNA对病毒相关基因的调控及对病毒复制的影响。本研究还初步揭示了RNA沉默抑制因子,即番茄丛矮病毒的P19蛋白,对宿主细胞周期相关基因有显著的调控作用。 Borf1蛋白是牛泡沫病毒编码的转录激活因子,可影响其自身及病毒结构基因的表达。但目前对Borf1在宿主细胞周期上是否发挥作用还不清楚。在本研究中,我们通过构建人胚肾293稳定表达Borf1的细胞系来研究其对宿主细胞的影响。研究发现,在细胞内稳定表达Borf1可显著引发细胞在G1/G0的阻滞,并且降低S期细胞的比例。用半定量RT-PCR分析发现,Borf1可在mRNA水平下调cyclin A2,cyclin B1,cyclin E1和CDC2,及上调CDK2和E2F-1的表达。蛋白水平的分析进一步核实上述结果,并且发现Borf1还可抑制P15蛋白表达。因此,...

目录:

泡沫病毒转录激活因子调控宿主细胞周期并受宿主细胞microRNA的调控

摘要 5-7
Abstract 7-9
第一章 引言 13-37
第一节 泡沫病毒 14-22
1.1.1 分类与感染特点 14-16
1.1.2 泡沫病毒的基因组结构与病毒蛋白表达 16-18
1.1.3 泡沫病毒的复制周期 18-21
1.1.4 泡沫病毒的转录激活调控 21-22
第二节 病毒感染与细胞周期 22-27
1.2.1 细胞周期调控概述 22-24
1.2.2 病毒蛋白对细胞周期的G0/G1期的阻滞 24-25
1.2.3 病毒蛋白对细胞周期的GZ/M期的阻滞 25-27
第三节 病毒感染与microRNA调控 27-34
1.3.1 microRNA的发现 27-28
1.3.2 病毒相关的miRNA类型及其作用的分子机制 28-29
1.3.3 病毒miRNA对靶序列的选择 29-31
1.3.4 病毒miRNA的作用特点 31-32
1.3.5 宿主miRNA对病毒感染的影响 32-34
第四节 本研究的目的和意义 34-37
第二章 材料与方法 37-60
第一节 材料 37-44
2.1.1 菌种与细胞 37
2.1.2 抗体及其相关产品 37
2.1.3 常用试剂盒 37-40
2.1.4 引物 40
2.1.5 限制性内切酶及修饰酶 40
2.1.6 常用克隆表达载体 40-44
2.1.7 构建基因表达质粒 44
第二节 实验方法 44-60
2.2.1 外源DNA转化大肠杆菌及T-A克隆转化 44-45
2.2.2 煮沸法提取质粒DNA 45-46
2.2.3 基因组DNA的提取 46
2.2.4 细胞总RNA的抽提 46-47
2.2.5 细胞培养 47
2.2.6 细胞转染 47-50
2.2.7 稳定细胞系的建立 50
2.2.8 细胞增殖检测[~3H]胸腺嘧啶掺入实验 50-51
2.2.9 胞蛋白裂解液的制备及其浓度检测 51-52
2.2.10 SDS-PAGE制备与免疫印迹杂交 52-54
2.2.11 流式检测细胞周期及凋亡 54-55
2.2.12 免疫荧光实验 55-56
2.2.13 聚合酶链式反应 56-57
2.2.14 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR) 57-58
2.2.15 实时定量RT-PCR检测 58-60
第三章 结果 60-84
第一节 牛泡沫病毒的转录激活子Borf1影响宿主周期蛋白表达 60-63
3.1.1 牛泡洙病毒转录激活子Borf1可诱发细胞G1期阻滞 60-61
3.1.2.Borf1对细胞周期相关基因mRNA表达水平的影响 61-62
3.1.3.Borf1对细胞周期相关基因蛋白表达水平的影响 62-63
第二节 RNA沉默抑制子p19调控细胞周期相关蛋白表达 63-72
3.2.1 构建及检测稳定表达p19的HEK293细胞系 63-64
3.2.2 P19蛋白限制细胞增殖并可引发293细胞的G2/M期阻滞 64-66
3.2.3 P19蛋白在促细胞凋亡中的作用 66-67
3.2.4 P19对细胞周期相关基因的mRNA表达谱的影响 67
3.2.5.P19对细胞周期相关基因的蛋白表达谱的影响 67-72
第三节 宿主microRNA对泡沫病毒转录激活因子Bel1的表达抑制 72-84
3.3.1 人泡沫病毒的复制受宿主小RNA的调控 72-73
3.3.2.microRNA真核表达质粒及携带靶位点的EGFP报告质粒的构建 73-74
3.3.3 has-miR-491-5p在人组织中的表达谱检测 74-75
3.3.4.has-miR-491-5p可显著抑制pEGFP-C1-T491的表达 75-78
3.3.5.has-miR-491-5p对pEGFP-C1-T491表达抑制的特异性研究 78-80
3.3.6.has-miR-491-5p介导的基因抑制作用发生于mRNA水平 80-81
3.3.7.has-miR-491-5p可特异性抑制HFV病毒感染中的Bel1蛋白的表达 81-84
第四章 讨论 84-91
第一节 Borf1可负调控宿主细胞周期 84-85
第二节 番茄丛矮病毒的p19蛋白对动物细胞周期有负调控作用 85-87
4.2.1 p19对成熟促进因子(MPF)的影响 85-86
4.2.2 p19对cyclin A2/cdk1活性的影响 86
4.2.3 p19有可能作用于多个细胞周期蛋白调控位点 86-87
第三节 宿主microRNA对HFV转录激活蛋白Bel1的负调控 87-91
结论 91-92
参考文献 92-101
附录1 个人履历 101-102
附录2 在学期间完成的论文 102-103
致谢 103


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